Approfondimento sulla specificità del legame peptidico al C-terminale del dominio PDZ dell’ossido nitrico sintasi neuronale

Studi precedenti hanno dimostrato che il c-jun e l’ossido nitrico sintasi neurale (nNOS) sono indotti nei motoneuroni danneggiati, ma il loro ruolo nella morte dei motoneuroni rimane poco chiaro.

• Abbiamo ipotizzato che nNOS potrebbe essere un ulteriore effettore della chinasi N-terminale c-jun (JNK) / c-jun nella morte per distacco del motoneurone. Qui abbiamo scoperto che il distacco della radice brachiale ha indotto un aumento transitorio dell’attività di JNK e un aumento di tre e quattro volte rispettivamente di fosfo-c-jun e c-jun; tuttavia, il distacco brachiale ha ridotto l’espressione della proteina nNOS da 4 ore a 14 giorni dopo la lesione.
• A 14 giorni dalla lesione, quasi tutti i motoneuroni nNOS-positivi erano localizzati insieme ai motoneuroni fosfo-c-jun positivi nelle corna addominali omolaterali.
• L’inibitore JNK SP600125, applicato immediatamente dopo la lesione, ha aumentato il livello della proteina nNOS sia nel midollo spinale che nei motoneuroni feriti e ha causato una leggera riduzione della morte dei motoneuroni inibendo la fosforilazione di c-jun 14 giorni dopo la lesione.
• I nostri risultati hanno mostrato che la via di trasduzione del segnale JNK / c-jun è coinvolta nel distacco della radice. L’inibizione della fosforilazione di c-jun impedisce che i livelli di nNOS scendano al di sotto della linea di base nel midollo spinale e mitiga parzialmente la morte del motoneurone dopo l’estrazione della radice.
• Pertanto, l’inibizione della fosforilazione di c-jun o l’aumento del livello della proteina nNOS in un midollo spinale danneggiato in una fase iniziale potrebbero essere utilizzati in futuro come strategie di bersaglio molecolare per prevenire la degenerazione dei motoneuroni durante l’eliminazione delle radici.

 

La coda C-terminale (CT) dell’ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS) è un elemento regolatorio che inibisce l’attività di nNOS in assenza di calmodulina legata (CaM).

 

Struttura cristallina del dominio nNOS reduttasi (nNOSr) (Garcin, ED, Bruns, CM, Lloyd, SJ, Hosfield, DJ, Tiso, M., Gachhui, R., Stuehr, DJ, Tainer, JA e Getzoff, ED (2004 ) J Biol. Chem. 279, 37918-37927) ha descritto come la prima metà di CT interagisce con nNOSr e ha quindi fornito un modello per uno studio dettagliato. Abbiamo generato mutanti troncati in nNOS e nNOSr per testare l’importanza di 3 diverse regioni CT.

• L’eliminazione della metà terminale di CT (tutti i residui da Ile1413 a Ser1429), che è invisibile nella struttura cristallina, non ha avuto quasi alcun effetto sul rilascio di NADP +, riduzione della flavina, autoossidazione della flavina, riduzione dell’eme, attività reduttasi o NO attività di sintesi, ma ha impedito un aumento della schermatura FMN che normalmente si verifica in risposta al legame NADPH.
• Un’ulteriore rimozione  dell’alfa-elica CT (residui da 1401 a 1412) ha aumentato significativamente il tasso di rilascio di NADP +, l’autoossidazione della flavina e l’attività della NADPH ossidasi e ha provocato un’esposizione eccessiva del cofattore FMN. Questi effetti sono stati associati con una maggiore attività della reduttasi e una riduzione leggermente ridotta dell’eme e della sintesi di NO.
• L’ulteriore rimozione dei residui dopo Gly1396 (troncamento CT completo) ha migliorato gli effetti sopra menzionati e ha ulteriormente modificato l’interazione di NADP + con FAD, attenuando la soppressione cinetica della riduzione della flavina e ulteriormente ridotta la riduzione dell’eme e la sintesi di NO.
•  I nostri risultati mostrano che la TC esercita effetti sia sfaccettati che regiospecifici sull’attività catalitica e sui comportamenti correlati, fornendo così nuove informazioni sui meccanismi che regolano la catalisi di nNOS.

I domini PDZ sono motivi di interazione proteica multifunzionale che spesso si legano al C-terminale delle proteine ​​​​bersaglio.

 L’ossido nitrico (NO), una molecola di segnalazione endogena, svolge un ruolo chiave nel funzionamento del sistema nervoso, immunitario e cardiovascolare. Sebbene ci siano molte funzioni fisiologiche per l’NO neuronale prodotto principalmente dalla NO sintasi neuronale (nNOS), l’eccessiva attività di nNOS media il danno cerebrale nell’ischemia cerebrale e nei modelli animali del morbo di Parkinson.

Pertanto, la localizzazione subcellulare dell’attività di nNOS deve essere strettamente regolata. Per determinare i ligandi del dominio nNOS PDZ, abbiamo cercato 13 miliardi di peptidi diversi e abbiamo scoperto che il dominio nNOS-PDZ si lega strettamente ai peptidi che terminano in Asp-X-Val. Questo differisce dall’unico consenso noto (Thr / Ser) -X-Val che interagisce con i domini PDZ di PSD-95. La preferenza per Asp in posizione -2 è mediata da Tyr-77 di nNOS. La sostituzione di Y77D78 con H77E78 cambia la specificità del legame da Asp-X-Val a Thr-X-Val. A seguito del consenso di Asp-X-Val, sono state identificate le proteine ​​candidate che interagiscono con nNOS, inclusi i recettori del glutammato e della melatonina. I nostri risultati mostrano che i domini PDZ hanno una chiara specificità di legame peptidico.

 

L’ossido nitrico sintasi neurale, a differenza delle sue controparti endoteliali e inducibili, mostra un dominio PDZ (PSD-95 / Dlg / ZO-1) situato al suo N-terminale coinvolto nel targeting subcellulare.

 Il C-terminale delle varie proteine ​​cellulari si inserisce nel solco di legame di questo dominio PDZ e definisce la distribuzione subcellulare della NOS neuronale (nNOS). I meccanismi molecolari alla base di queste interazioni sono poco conosciuti poiché il dominio nNOS PDZ può sembrare mostrare specificità di legame di classe I, classe II e classe III.

Inoltre  , è stato recentemente suggerito che il dominio nNOS PDZ si leghi con un’affinità molto bassa al C-terminale delle proteine ​​bersaglio e che la necessaria interazione laterale concomitante debba avvenire affinché avvenga il legame. Descriviamo qui che un dominio nNOS PDZ può comportarsi come un dominio PDZ di classe III in buona fede e legarsi a sequenze C-terminali con residui acidi nella posizione P-2 con costanti micromolari basse. Può verificarsi anche il legame alle sequenze C-terminali con un residuo idrofobo in P-2 e un residuo acido in P-3 (classe II), sebbene interazioni che coinvolgono residui che si estendono a P-7 mediano questo tipo di legame.

Questo comportamento promiscuo si estende anche alla sua associazione con sequenze di classe I, che devono mostrare un residuo di Glu in P-3 e un residuo di Thr in P-2. Mediante mutagenesi sito-diretta e spettroscopia NMR, siamo stati in grado di identificare i residui coinvolti in ogni tipo specifico di legame e razionalizzare i meccanismi utilizzati per riconoscere i partner vincolanti.

 

Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
20-abx103474	Abbexa	411.00 EUR 133.00 EUR 1135.00 EUR 551.00 EUR 314.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
20-abx103476	Abbexa	425.00 EUR 133.00 EUR 1177.00 EUR 578.00 EUR 328.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody
20-abx173833	Abbexa	314.00 EUR 787.00 EUR 411.00 EUR 154.00 EUR 258.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E02N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Mouse Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E03N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Mouse Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E03N0069-48	BlueGene	1 plate of 48 wells	520 EUR
Mouse Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E03N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Human Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E01N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Human Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E01N0069-48	BlueGene	1 plate of 48 wells	520 EUR
Human Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E01N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E07N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E07N0069-48	BlueGene	1 plate of 48 wells	520 EUR
Pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E07N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Goat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Goat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Goat Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Rabbit Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Rabbit Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Rabbit Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Dog Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E08N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Dog Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Dog Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Monkey Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E09N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Monkey Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
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Monkey Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E09N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody
abx122667-100ug	Abbexa	100 ug	391 EUR
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody
abx025659-400ul	Abbexa	400 ul	523 EUR
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody
abx025659-80l	Abbexa	80 µl	286 EUR
C-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (CAPON) Antibody
abx430457-200ul	Abbexa	200 ul	384 EUR
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody
20-abx302365	Abbexa	411.00 EUR 1845.00 EUR 599.00 EUR 182.00 EUR 300.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Human Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS) ELISA Kit
CSB-E13872h-24T	Cusabio	1 plate of 24 wells	165 EUR
Human Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS) ELISA Kit
1-CSB-E13872h	Cusabio	703.00 EUR 4843.00 EUR 2570.00 EUR	1 plate of 96 wells 10 plates of 96 wells each 5 plates of 96 wells each
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody Pair
20-abx370344	Abbexa	1706.00 EUR 1094.00 EUR	10 × 96 tests 5 × 96 tests
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
20-abx068295	Abbexa	704.00 EUR 286.00 EUR 2165.00 EUR 829.00 EUR 495.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
20-abx068296	Abbexa	732.00 EUR 286.00 EUR 2263.00 EUR 871.00 EUR 523.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Mouse Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
20-abx068297	Abbexa	704.00 EUR 286.00 EUR 2179.00 EUR 843.00 EUR 509.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Mouse Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
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Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
20-abx068299	Abbexa	732.00 EUR 286.00 EUR 2263.00 EUR 871.00 EUR 523.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Mouse Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
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Mouse Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
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Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Protein
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody (Biotin)
20-abx274315	Abbexa	425.00 EUR 230.00 EUR 1205.00 EUR 578.00 EUR 328.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody (Biotin)
20-abx272743	Abbexa	467.00 EUR 244.00 EUR 1344.00 EUR 634.00 EUR 342.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Antibody (Biotin)
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal / nNOS (NOS1) Antibody
20-abx329607	Abbexa	314.00 EUR 244.00 EUR	100 ug 50 ug
Guinea pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E05N0069-192T	BlueGene	192 tests	1270 EUR
Guinea pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E05N0069-48	BlueGene	1 plate of 48 wells	520 EUR
Guinea pig Neuronal Nitric Oxide Synthase ELISA kit
E05N0069-96	BlueGene	1 plate of 96 wells	685 EUR
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody (HRP)
20-abx317052	Abbexa	411.00 EUR 1845.00 EUR 599.00 EUR 182.00 EUR 300.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody (FITC)
20-abx317053	Abbexa	411.00 EUR 1845.00 EUR 599.00 EUR 182.00 EUR 300.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Carboxyl-Terminal PDZ Ligand of Neuronal Nitric Oxide Synthase Protein (NOS1AP) Antibody (Biotin)
20-abx317054	Abbexa	411.00 EUR 1845.00 EUR 599.00 EUR 182.00 EUR 300.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1)CLIA Kit
SCA815Hu-10x96wellstestplate	Cloud-Clone	10x96-wells test plate	5647.8 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1)CLIA Kit
SCA815Hu-1x48wellstestplate	Cloud-Clone	1x48-wells test plate	552.76 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1)CLIA Kit
SCA815Hu-1x96wellstestplate	Cloud-Clone	1x96-wells test plate	746.8 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1)CLIA Kit
SCA815Hu-5x96wellstestplate	Cloud-Clone	5x96-wells test plate	3060.6 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) CLIA Kit
4-SCA815Hu	Cloud-Clone	5698.00 EUR 3061.00 EUR 747.00 EUR	10 plates of 96 wells 5 plates of 96 wells 1 plate of 96 wells
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Hu-10x96wellstestplate	Cloud-Clone	10x96-wells test plate	4273.35 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
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Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Hu-1x96wellstestplate	Cloud-Clone	1x96-wells test plate	585.1 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Hu-5x96wellstestplate	Cloud-Clone	5x96-wells test plate	2332.95 EUR
Human Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
4-SEA815Hu	Cloud-Clone	4324.00 EUR 2283.00 EUR 586.00 EUR	10 plates of 96 wells 5 plates of 96 wells 1 plate of 96 wells
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Ra-10x96wellstestplate	Cloud-Clone	10x96-wells test plate	4626.78 EUR
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Ra-1x48wellstestplate	Cloud-Clone	1x48-wells test plate	468.68 EUR
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Ra-1x96wellstestplate	Cloud-Clone	1x96-wells test plate	626.68 EUR
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
SEA815Ra-5x96wellstestplate	Cloud-Clone	5x96-wells test plate	2520.06 EUR
Rat Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) ELISA Kit
4-SEA815Ra	Cloud-Clone	4677.00 EUR 2471.00 EUR 627.00 EUR	10 plates of 96 wells 5 plates of 96 wells 1 plate of 96 wells
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Polyclonal Antibody (Human)
4-PAA815Hu01	Cloud-Clone	232.00 EUR 2285.00 EUR 574.00 EUR 289.00 EUR 208.00 EUR	100ul 10ml 1ml 200ul 20ul
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Polyclonal Antibody (Mouse)
4-PAA815Mu01	Cloud-Clone	236.00 EUR 2338.00 EUR 586.00 EUR 294.00 EUR 209.00 EUR	100ul 10ml 1ml 200ul 20ul
Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Polyclonal Antibody (Mouse)
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Polyclonal Antibody (Mouse)
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Nitric Oxide Synthase 1, Neuronal (NOS1) Polyclonal Antibody (Rat)
4-PAA815Ra03	Cloud-Clone	243.00 EUR 2457.00 EUR 613.00 EUR 305.00 EUR 212.00 EUR	100ul 10ml 1ml 200ul 20ul
Mouse Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS/NOS1) ELISA Kit
CSB-E13273m-24T	Cusabio	1 plate of 24 wells	165 EUR
Mouse Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS/NOS1) ELISA Kit
1-CSB-E13273m	Cusabio	703.00 EUR 4843.00 EUR 2570.00 EUR	1 plate of 96 wells 10 plates of 96 wells each 5 plates of 96 wells each
Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS/NOS1) ELISA Kit
CSB-E14034r-24T	Cusabio	1 plate of 24 wells	165 EUR
Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS/NOS1) ELISA Kit
1-CSB-E14034r	Cusabio	703.00 EUR 4843.00 EUR 2570.00 EUR	1 plate of 96 wells 10 plates of 96 wells each 5 plates of 96 wells each
Rat neuronal nitric oxide synthase(NOS,nNOS)ELISA Kit
GA-E0550RT-48T	GenAsia Biotech	48T	317 EUR
Rat neuronal nitric oxide synthase(NOS,nNOS)ELISA Kit
GA-E0550RT-96T	GenAsia Biotech	96T	496 EUR

Infine, abbiamo analizzato l’associazione ad alta affinità del dominio nNOS PDZ con Claudin-3 e Claudin-14, due proteine ​​di membrana tetraspan strettamente collegate che sono componenti essenziali della barriera paracellulare.