Sistema Lab-on-a-chip che integra la preparazione del campione di tessuto e multiplex RT-qPCR per l’analisi dell’espressione genica nella valutazione dell’epatotossicità nel luogo di cura

Tomografia al microcomputer  di rocce arenarie: set di dati grezzi, filtrati e segmentati La microtomografia computerizzata ad alta risoluzione è un importante campo della scienza che si correla bene con diverse metodologie sperimentali e funge da base per la ricerca di fisica computazionale avanzata in cui le immagini ad alta risoluzione vengono utilizzate come input per vari modelli di simulazione scientifica. 

Il set di dati qui presentato include immagini in scala di grigi (grezze) ottenute con un tomografo a raggi X Bruker Skyscan 1272; immagini filtrate ottenute con filtri per aumentare il contrasto e ridurre il rumore; e immagini segmentate ottenute utilizzando il metodo di segmentazione IsoData. Tutte le immagini hanno una risoluzione di 2,25 µm (voxel isometrici) e una dimensione di 1000  3   voxel.

Microenucleazione intracapsulare di un   neuroma peroneo superficiale doloroso  in un uomo di 60 anni: un incontro raro

  •  Schwannom sono le neoplasie benigne più comuni delle guaine nervose periferiche, localizzate principalmente nei nervi cranici e nelle estremità superiori. La loro presenza negli arti inferiori è rara e il coinvolgimento specifico del nervo peroneo superficiale è estremamente raro.
  •  Presentiamo un caso di neuroma del nervo peroneo superficiale destro doloroso che è stato asportato utilizzando la tecnica di microenucleazione intracapsulare. Un uomo dell’Asia meridionale di 60 anni che ha avuto un nodulo doloroso sulla superficie laterale della parte superiore della gamba destra per 2 anni. 
  • L’esame clinico ha rivelato una massa compatta di circa 3 × 2,5 cm situata nella parte laterale prossimale della gamba destra. C’era una forte tenerezza sulla massa. Il test di Tinel è risultato positivo. Non c’era storia di deficit sensoriali o motori o neurofibromatosi.
  • L’imaging ha mostrato caratteristiche suggestive di schwannoma. È stato indicato l’intervento chirurgico; È stata eseguita la microenucleazione intracapsulare. La valutazione istopatologica del tumore ha rivelato i modelli Antoni A e B con una palizzata nucleare  e corpi di Verocay, caratteristiche del neuroblastoma. Il periodo postoperatorio è stato regolare  ; non sono stati riscontrati deficit neurologici.
  •  Il caso descritto è considerato raro, non sono disponibili dati in letteratura sull’epidemiologia della malattia. Forniamo una breve panoramica e aggiungiamo dati chiave alla letteratura. Nonostante la sua rarità, è importante essere consapevoli di questa condizione e includerla nella diagnosi differenziale del dolore alle gambe non traumatico. 
  • Sulla base della nostra esperienza, della conferma da precedenti case report e dell’esito soddisfacente del nostro caso, raccomandiamo l’uso della tecnica di microenucleazione intracapsulare, se possibile, per i neuroblastomi.
  • Un sistema lab-on-a-chip (LOC) veramente pratico per la valutazione dell’epatotossicità nel punto di cura (POCT) richiede l’incarnazione della completa automazione, facilità d’uso e diagnostica della risposta del campione. I dispositivi di epatotossicità POCT microfluidici finora riportati rimangono rudimentali poiché includono in gran parte solo capacità di rilevamento semiquantitativo o di singolo campione/gene. 
  • In questo articolo, descriviamo per la prima volta il sistema LOC integrato, che è in qualche modo simile a un pratico dispositivo di valutazione dell’epatotossicità POCT: copre sia la preparazione di campioni di tessuto che la RT-PCR multiplex in tempo reale. È semiautomatico, relativamente facile da usare e ha capacità campione per risposta per l’analisi dell’espressione genica multiplex.
  • Il nostro modulo di preparazione dei campioni di tessuto, contenente sia   un microomogeneizzatore  che microsfere paramagnetiche trattate in superficie, ha prodotto estratti di mRNA di elevata purezza, di gran lunga superiori ai metodi di estrazione manuale. 
  • La procedura di precarico primer e ingresso singolo nel nostro modulo RT-PCR multiplex in tempo reale semplifica  le procedure di gestione fuori chip per facilità d’uso. Per dimostrare l’efficacia del nostro sistema LOC per la valutazione dell’epatotossicità POCT,  conduciamo uno studio preclinico su animali con la somministrazione di ciclofosfamide e quindi eseguiamo l’analisi dell’espressione genica di due biomarcatori proteici chiave nei test di funzionalità epatica, l’aspartato transaminasi (AST) e l’alanina transaminasi (ALT).

I nostri risultati sperimentali mostrano cambiamenti di piega normalizzati di 1,62 e 1,31 rispettivamente per AST e ALT, illustrando la sovraregolazione dei loro livelli di espressione e confermando così la loro selezione come geni critici di interesse. In breve, illustriamo la fattibilità dell’analisi dell’espressione genica multiplex in un sistema LOC integrato come agenti POCT efficaci per valutare l’epatotossicità.

Estrazione dell’RNA in una fase da varie cellule staminali mesenchimali incorporate in un idrogel per l’analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa

In molte applicazioni di ingegneria tissutale, cellule come le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) devono essere incorporate negli idrogel. L’analisi degli hMSC incorporati richiede l’estrazione dell’RNA, ma le procedure di estrazione convenzionali spesso si traducono in una bassa resa e/o RNA di bassa qualità. Abbiamo testato sistematicamente quattro metodi di omogeneizzazione combinati con otto protocolli di estrazione dell’RNA per hMSC incorporati in tre tipi comuni di idrogel (alginato, agarosio e gelatina). 
Per tutti e tre i tipi di idrogel, abbiamo scoperto che una bassa resa di RNA è stata ottenuta utilizzando azoto liquido o un rotore-statore, mentre utilizzando un   microomogeneizzatore   o una digestione enzimatica/chimica di idrogel, sono state ottenute rese migliori, indipendentemente dal protocollo di estrazione che era poi applicato.
Il protocollo di estrazione del fenolo caldo ha generalmente raggiunto il picco di A260 (che rappresenta fino a 40,8 μg di RNA per 10 (6) cellule), ma il metodo del bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) ha prodotto  un RNA di migliore qualità, con rapporti A260 / A280 e A260 / A230 e spettri UV simili ai controlli di RNA puro.
L’RNA prodotto con questo metodo era adatto anche come modello per l’endpoint e la trascrizione inversa quantitativa-PCR (qRT-PCR), ottenendo bassi valori di Ct di ~ 20. Un’attenta selezione dei metodi di omogeneizzazione dell’idrogel e di estrazione dell’RNA può garantire la preparazione di RNA di alta qualità che genera dati endpoint affidabili e dati RT-PCR quantificati. Pertanto, proponiamo un metodo universale adatto per l’estrazione di RNA da cellule incorporate in tutti e tre i tipi di idrogel comunemente usati nell’ingegneria dei tessuti.

Introduzione di farmaci idrosolubili nelle microsfere PLGA

Microsfere di poli (lattide-co-glicolide) (PLGA) contenenti blu destrano come modello di farmaci idrosolubili sono state preparate dall’emulsione in (1) / o / w (2) utilizzando un   microomogeneizzatore  e un metodo di evaporazione del solvente. Effetto delle condizioni di preparazione come concentrazione di alcol polivinilico (PVA) nella fase in (2), viscosità della fase acquosa interna solubile, rapporto in volume tra fase oleosa e fase in (1) nell’emulsione primaria, concentrazione di PLGA nella fase oleosa, e il peso molecolare o la composizione del PLGA, in base alle proprietà delle microsfere di PLGA contenenti i farmaci idrosolubili.
La concentrazione di alcol polivinilico (PVA), il disperdente disciolto nella fase (2) dell’emulsione secondaria, non ha mostrato alcun effetto sulla dimensione delle particelle finali. D’altra parte, il rapporto tra il volume della fase oleosa e l’acqua  nell’emulsione primaria ha influenzato la dimensione delle particelle finali che sembrava essere correlata alla concentrazione locale di PLGA nelle emulsioni in (1) / o. Ciò significa che la dimensione delle particelle aumenta con l’aumentare del rapporto tra il volume della fase in (1) e la fase olio, w (1) / o (v / v).
Tuttavia, l’efficienza di caricamento non è stata influenzata dal rapporto di volume w (1) / o (v / v), ma dalla concentrazione di destrano blu nella fase in (1). È stata osservata una maggiore efficienza di caricamento nelle microsfere PLGA preparate dalla fase w (1) contenenti una concentrazione inferiore di destrano blu. Una soluzione di destrano blu meno viscosa (fase acquosa interna) può comportare un tasso di perdita inferiore del destrano blu durante la procedura di preparazione. L’aumento della concentrazione di PLGA e del peso molecolare ha comportato un aumento della dimensione delle particelle.

Lipasi lipoproteica del tessuto mammario di capra: un confronto tra metodi di estrazione

 

La lipoproteina lipasi della ghiandola mammaria nelle capre in allattamento è stata estratta con 3 metodi: omogeneizzazione di polveri tissutali acetone-etere; omogeneizzazione acquosa di tessuto grezzo utilizzando l’apparato Ultra-Turrax; omogeneizzazione acquosa del tessuto grezzo utilizzando   il microomogeneizzatore Sorvall Omni-mixer.
 Nonostante ci fossero differenze tra i valori assoluti ottenuti con i tre metodi, ogni tipo di omogenato ha mostrato attività lipolitica con caratteristiche della lipoproteina lipasi (cioè maggiore del 90% di inibizione omettendo il siero o aggiungendo NaCl). Inoltre, questi 3 metodi erano altamente correlati e mostravano differenze simili durante il periodo di allattamento, parallelamente alla secrezione di acidi grassi a catena lunga nel latte.

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 La riproducibilità della misurazione delle attività lipolitiche dell’omogenato era di circa l’8%, mentre la riproducibilità quotidiana dell’estrazione e del dosaggio dell’enzima era di circa il 20% per ciascun metodo.

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