Espianto di tessuto 3D e sistemi di coltura di organoidi in sospensione unicellulare per test antidroga ex vivo su cellule T helper follicolari derivate dalle tonsille umane

La ricerca sul sistema immunitario umano è spesso limitata alle cellule del sangue periferico. Tuttavia, queste cellule possono essere diverse da quelle che si trovano negli organi linfoidi secondari. Ad esempio, le cellule T e B specializzate che sono localizzate nei centri germinali (GC), che sono strutture anatomiche complesse necessarie per la generazione di potenti anticorpi, non si trovano nel sangue periferico.

La maggior parte delle cellule T helper localizzate nei GC appartengono al sottoinsieme delle cellule T helper follicolari (Tfh), che fornisce un supporto critico alle cellule B. Le cellule umane GC Tfh in buona fede possono essere ottenute da tessuti linfoidi secondari come le tonsille, che vengono regolarmente rimosse mediante intervento chirurgico.

Descriviamo qui un metodo che si basa sull’istocoltura linfoide umana (HLH) e sulla coltura di aggregati linfoidi umani (HLAC) per la coltura del tessuto adenoide umano (tonsille faringee) ex vivo, seguita dalla fenotipizzazione delle cellule Tfh profonda mediante citometria a flusso.

Questo metodo consente di studiare le cellule Tfh in un versatile sistema di coltura espiantato che preserva molti aspetti della struttura tridimensionale (3D) in vivo originale, in parallelo alle colture organoidi in sospensione unicellulare in cui la struttura tissutale originale è disintegrata. Descriviamo anche come questa piattaforma versatile può essere utilizzata per test sui farmaci o manipolazione di cellule Tfh umane in vitro per studi meccanicistici.

 

Un dispositivo di dialisi-coltura in miniatura consente l’espansione di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo ad alta densità dall’accumulo di fattori di crescita

 

La coltura tridimensionale in sospensione aggregata è un potenziale metodo di bioproduzione per produrre un gran numero di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs); Tuttavia, l’uso di fattori di crescita costosi e stress meccanico indotto dal metodo potenzialmente comporta costi di produzione inefficienti e difficoltà nel preservare la pluripotenza, rispettivamente.
Qui, abbiamo sviluppato un dispositivo di dialisi-coltura semplice, miniaturizzato, a doppio scomparto basato su un inserto di coltura a membrana convenzionale con piastre a pozzetti profondi. Il dispositivo ha migliorato l’espansione cellulare fino a circa ~ 3,2 – 4 × 10 celle/ml. L’espansione ad alta densità è stata supportata dalla riduzione dello stress da taglio eccessivo e dall’agglomerazione mediata dall’aggiunta del polimero funzionale FP003.
I risultati hanno rivelato l’accumulo di diversi fattori di crescita, tra cui il fattore di crescita dei fibroblasti 2 e l’insulina, insieme al Nodal endogeno, che agisce come sostituto del fattore di crescita trasformante impoverito-β1 nel mantenimento della pluripotenza.
Poiché abbiamo utilizzato la stessa formulazione del fattore di crescita per volume nel compartimento di coltura superiore, il costo è stato ridotto in modo inversamente proporzionale alla densità cellulare. Abbiamo dimostrato che le dinamiche di accumulo del fattore di crescita in un ambiente a basso stress da taglio hanno migliorato con successo la proliferazione, la pluripotenza e il potenziale di differenziazione di hiPSC. Questo sistema miniaturizzato di dialisi-coltura ha dimostrato la fattibilità di una produzione di massa economica di hiPSC in colture ad alta densità.

Iota-carragenina e xilitolo inibiscono SARS-CoV-2 nella coltura cellulare Vero

 

L’anno scorso è stata osservata una pandemia globale causata dall’infezione da SARS-CoV-2 (sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2) che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. C’è un’urgente necessità insoddisfatta di fornire una medicina facilmente producibile e conveniente per prevenire la trasmissione e fornire un trattamento precoce per questa malattia.
Poiché la cavità nasale e il rinofaringe sono i siti di replicazione iniziale di SARS-CoV-2, uno spray nasale può essere un’opzione efficace per colpire l’infezione da SARS-CoV-2. In questo studio, abbiamo testato l’azione antivirale di tre formulazioni spray nasali candidate contro SARS-CoV-2 in vitro. Abbiamo determinato che iota-carragenina in concentrazioni fino a 6/g/ml inibisce SARS-CoV-2 in vitro.
Le concentrazioni di iota-carragenina con attività contro SARS-CoV-2 in vitro possono essere facilmente raggiunte attraverso l’applicazione di spray nasali comunemente usati in diversi paesi. Recentemente uno studio in doppio cieco, controllato con placebo ha mostrato che lo iota-carragenina nel cloruro di sodio isotonico riduce ca. cinque volte il rischio di infezione da SARS-CoV-2 nel personale sanitario. Inoltre, è stato riscontrato che lo xilitolo a una concentrazione di 50 mg/ml (ca. 329 mM) esercita una certa azione antivirale, sebbene questa scoperta preliminare necessiti di ulteriori conferme.

Prototipazione rapida di microdispositivi per colture cellulari utilizzando stampe 3D rivestite di parylene

 

La fabbricazione di dispositivi microfluidici mediante fotolitografia richiede generalmente una formazione specializzata e l’accesso a una camera bianca. In alternativa, la stampa 3D consente la fabbricazione economica di microdispositivi con caratteristiche complesse che sarebbero adatte a molte applicazioni biomediche. Tuttavia, le resine comunemente usate sono citotossiche e non adatte a dispositivi che coinvolgono le cellule. Inoltre, le stampe 3D sono generalmente refrattarie alla polimerizzazione degli elastomeri in modo tale da non poter essere utilizzate come stampi master per la fabbricazione di dispositivi da polimeri ( ad esempio polidimetilsilossano o PDMS)..
Diverse strategie di trattamento post-stampa, come la polimerizzazione a caldo, l’esposizione alla luce ultravioletta e il rivestimento con silani, sono state esplorate per superare questi ostacoli, ma nessuna si è dimostrata universalmente efficace. Qui mostriamo che la deposizione di un sottile strato di parylene, un polimero comunemente usato per applicazioni di dispositivi medici, rende le stampe 3D biocompatibili e consente loro di essere utilizzate come stampi master per la fabbricazione di dispositivi elastomerici.
Quando vengono poste in piatti di coltura contenenti neuroni umani, indipendentemente dal tipo di resina, le stampe 3D non rivestite stampano materiale tossico lisciviato per produrre la morte cellulare completa entro 48 ore, mentre le cellule hanno mostrato vitalità uniforme e morfologia sana fino a 21 giorni se le stampe sono state rivestite con parylene. Diversi dispositivi PDMS di diverse forme e dimensioni sono stati facilmente colati da stampi stampati in 3D rivestiti di parylene senza difetti visibili.
Come prova del concetto, abbiamo rapidamente prototipato e testato diversi tipi di dispositivi PDMS, inclusi chip di perfusione a camera tripla, generatori di gocce e micropozzetti. Nel complesso, suggeriamo che la semplicità e la riproducibilità di questa tecnica la renderanno attraente per la fabbricazione di microdispositivi tradizionali e la prototipazione rapida di nuovi progetti.
In particolare, riducendo al minimo l’intervento dell’utente nelle fasi di fabbricazione e trattamento post-stampa, la nostra strategia potrebbe aiutare a rendere la microfluidica più accessibile alla comunità della ricerca biomedica.

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Fish Serum (cell culture grade)

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Ampicillin sodium salt, cell culture grade

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