Istituzione di PANDA – una nuova linea cellulare di adenocarcinoma duttale pancreatico umano con tecnologia di coltura cellulare 3D

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è un tipo di tumore maligno altamente aggressivo con una delle peggiori prognosi tra tutti i tipi di cancro. La chirurgia è applicabile solo al numero limitato di pazienti con tumori resecabili localmente e rappresenta attualmente l’unica opzione di trattamento curativo.
Il trattamento con chemioterapia e radioterapia può solo prolungare la sopravvivenza del paziente. Nonostante i progressi nelle terapie convenzionali, la sopravvivenza a cinque anni del PDAC è rimasta sostanzialmente invariata. Sono quindi urgentemente necessari nuovi modelli in vitro e in vivo per studiare questo tipo di cancro.
Qui, presentiamo l’istituzione e la caratterizzazione di una nuova linea cellulare di cancro al pancreas, isolata da un paziente con PDAC. La linea cellulare abbreviata in PANDA (PANncreatic Ductal Adenocarcinoma) è stata stabilita con un protocollo di coltura 3D ottimizzato pubblicato in precedenza dal nostro gruppo. La nuova linea di cellule cancerose “PANDA” rappresenta un nuovo approccio in vitro per la ricerca sul cancro PDAC e nuovi test terapeutici.

Consumo di glucosio di tipi di cellule vascolari in coltura; verso l’ottimizzazione delle condizioni sperimentali

In questo studio, abbiamo cercato una concentrazione media di glucosio ottimale e confrontato il consumo di glucosio in tre tipi di cellule vascolari, cellule endoteliali (CE), cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) e fibroblasti avventiziali (AF) con o senza angiotensina II (AngII) . stimolazione. In un esperimento a 6 pozzetti subconfluenti in 1 mL di DMEM con una concentrazione di glucosio standard bassa (100 mg/dL), alta standard (450 mg/dL) o media mista (275 mg/dL), costante e significativa Il consumo di glucosio è stato osservato in tutti i tipi di cellule.
  • Dopo 48 ore di incubazione, i terreni che contenevano glucosio basso sono stati ridotti a quasi 0 mg / dL, i terreni che contenevano glucosio alto sono rimasti significativamente più alti a ~ 275 mg / dL e i terreni che contenevano glucosio medio sono rimasti più vicini al range fisiologico.
  • Il trattamento con AngII ha aumentato il consumo di glucosio in AF e VSMC ma non in EC. Nella fibrillazione atriale è stato osservato anche un aumento del tasso di acidificazione extracellulare da parte di AngII. Nella FA, l’induzione di AngII delle proteine bersaglio a 48 ore variava a seconda della concentrazione di glucosio utilizzata.
  • In terreni a basso contenuto di glucosio l’induzione della proteina regolatrice del glucosio 78 o dell’esochinasi II era più alta, mentre l’induzione di VCAM-1 era più bassa. L’utilizzo di inibitori specifici suggerisce inoltre ruoli essenziali del recettore AT1 e della glicolisi nell’attivazione dei fibroblasti indotta da AngII.
  • Nel complesso, il presente studio dimostra un alto rischio di condizioni ipo o iperglicemiche quando si utilizzano terreni standard a basso o alto livello di glucosio con le cellule vascolari. Inoltre, queste condizioni possono alterare significativamente i risultati sperimentali.
  • La concentrazione di glucosio nel terreno deve essere monitorata durante qualsiasi esperimento di coltura e l’utilizzo del glucosio nel terreno medio è raccomandato per tutti i tipi di cellule vascolari.

Colture cellulari di mammifero come piattaforma per i vaccini veterinari

 

Da oltre tre decenni, le cellule di mammifero sono l’ospite per eccellenza per la produzione di proteine ricombinanti a scopo terapeutico nell’uomo. A causa dell’alto costo dei mezzi e di altri materiali di consumo utilizzati per la crescita cellulare, inizialmente questa piattaforma di espressione era utilizzata solo per la produzione di proteine di importanza farmaceutica, compresi gli anticorpi.

Tuttavia, le grandi aziende biotecnologiche che hanno utilizzato questa piattaforma hanno continuato la ricerca per migliorarne la fattibilità tecnica ed economica. Il principale miglioramento qualitativo è stato ottenuto quando le singole cellule potevano essere coltivate in un mezzo liquido simile a colture di batteri e lieviti. Un’altra importante innovazione per la crescita di cellule in sospensione è stato il miglioramento dei terreni chimicamente definiti che non contengono macromolecole; erano più economici da coltivare come qualsiasi altro mezzo microbico.

Queste pietre miliari scientifiche hanno ridotto il costo della coltura cellulare di mammifero e il loro utilizzo per ottenere proteine per uso veterinario. La facilità di lavorare con colture cellulari di mammifero ha consentito l’uso di questa piattaforma di espressione per produrre ingredienti farmaceutici attivi per vaccini veterinari. In questo capitolo verrà descritto il protocollo per ottenere linee cellulari di mammifero ricombinanti.

Istituzione di un modello di tessuto simile al trofoblasto da cellule staminali pluripotenti umane in un sistema di coltura tridimensionale

La placenta ha un impatto permanente sulla salute sia della madre che del feto. Nonostante il suo significato, lo sviluppo placentare precoce umano è poco compreso a causa dei modelli limitati. Mancano ancora i modelli che possano riflettere le caratteristiche chiave dello sviluppo placentare umano precoce, specialmente all’inizio della gestazione.
Qui, gli autori riportano la generazione di modelli di tessuto simile al trofoblasto da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in colture tridimensionali (3D). Le hPSC si auto-organizzano in modo efficiente in cavità simili a blastocele in condizioni definite, che producono diversi sottotipi di trofoblasti, inclusi citotrofoblasti (CTB), sinciziotrofoblasti (STB) e trofoblasti extravilli invasivi (EVT).
Le colture 3D possono esibire la struttura dei microvilli e secernere l’ormone umano specifico della placenta. L’analisi del sequenziamento dell’RNA a cellula singola identifica ulteriormente la presenza dei principali tipi cellulari di tessuto simile al trofoblasto come esistenti in vivo.
I risultati rivelano la fattibilità di stabilire un modello di tessuto 3D simile al trofoblasto da hPSC in vitro, che non è ottenuto dalla coltura monostrato. Questo nuovo sistema modello può non solo facilitare la dissezione dei meccanismi sottostanti dello sviluppo placentare umano precoce, ma implica anche il suo potenziale per lo studio nella biologia dello sviluppo e nei disturbi gestazionali.

Utilizzo di MVDA con bilance stechiometriche per ottimizzare le concentrazioni di aminoacidi nel terreno di coltura cellulare CHO chimicamente definito per migliorare le prestazioni di coltura

 

I terreni chimicamente definiti (CD) vengono utilizzati abitualmente nella produzione di prodotti biologici nella coltura cellulare dell’ovaio di criceto cinese (CHO) e forniscono un controllo avanzato delle materie prime. I supporti CD ottimizzati per i nutrienti sono un percorso importante per aumentare la crescita cellulare e la produttività degli anticorpi monoclonali (mAb) nelle linee cellulari CHO ricombinanti.
Tuttavia, gli sforzi di ottimizzazione dei nutrienti per i supporti CD in genere si basano su approcci di progettazione sperimentale e multifattoriale di esperimenti (DoE) o su modelli matematici complessi del metabolismo cellulare o sui sistemi di espressione genica.
Inoltre, la maggior parte di questi sforzi è rivolta agli amminoacidi poiché costituiscono nutrienti essenziali nei supporti CD poiché contribuiscono direttamente alla produzione di biomassa e proteine. In questo studio, dimostriamo l’utilizzo dell’analisi dei dati multivariata (MVDA) accoppiata con gli equilibri stechiometrici degli amminoacidi (SB) per aumentare la crescita cellulare e la produttività di mAb negli sforzi per supportare gli sforzi di sviluppo dei supporti CD.
Gli SB misurano la differenza tra la domanda teorica di amminoacidi e i flussi misurati empiricamente per identificare vari stati catabolici o anabolici della cellula. Quando accoppiati con MVDA, i modelli statistici non solo sono stati in grado di evidenziare gli amminoacidi chiave per la crescita o la produttività cellulare, ma hanno anche fornito indicazioni sulla preferenza metabolica dell’amminoacido.
La convalida sperimentale del nostro approccio ha portato a un aumento del 55% della crescita totale delle cellule e di circa l’80% della produttività totale di mAb. È stato inoltre osservato un aumento del consumo specifico di amminoacidi stechiometricamente bilanciati e una diminuzione del consumo specifico di glucosio nei supporti CD ottimizzati, suggerendo un consumo favorevole dei nutrienti desiderati e un potenziale di ridistribuzione dell’energia verso una maggiore crescita cellulare e produttività di mAb. Questo articolo è protetto da copyright. Tutti i diritti riservati.

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