Etichettatura isotopica spaziale stabile da parte degli aminoacidi in coltura cellulare: etichettatura pulsata di sferoidi multicellulari tridimensionali per l’analisi globale del proteoma

Le colture cellulari tridimensionali, o sferoidi, sono importanti sistemi modello per la ricerca sul cancro perché ricapitolano gli aspetti chimici e fenotipici dei tumori in vivo. Gli sferoidi sviluppano gradienti chimici radialmente simmetrici, risultando in popolazioni cellulari distinte. L’etichettatura isotopica stabile di amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) è un approccio consolidato per quantificare l’espressione proteica ed è stato precedentemente utilizzato in un formato a sequenza di impulsi per valutare i cambiamenti temporali.
In questo articolo, dimostriamo che le firme isotopiche distinte possono essere introdotte in popolazioni cellulari spaziali discrete, tracciando efficacemente le proteine nelle posizioni originali nello sferoide, utilizzando una piattaforma che chiamiamo SILAC spaziale. Le popolazioni di sferoidi sono state coltivate con mezzi isotopici leggeri, medi e pesanti e i gusci concentrici delle cellule sono stati raccolti mediante tripsinizzazione seriale. Le proteine sono state analizzate quantitativamente mediante cromatografia liquida ad alta prestazione-spettrometria di massa tandem.
Le firme isotopiche correlate con la posizione spaziale e la posizione dell’isotopo non hanno un impatto significativo sul proteoma di ogni singolo strato. SILAC spaziale può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti proteomici nei diversi strati dello sferoide e per identificare i biomarcatori proteici in tutta la struttura. Mostriamo che le etichette SILAC possono essere pulsate discretamente in posizioni discrete, senza alterare il proteoma dello sferoide, promettendo futuri studi farmacodinamici e farmacocinetici combinati.

Coltura in vitro Modello di cellule di Muller per studiare il ruolo della tecnica del lembo di membrana limitante interna invertita nella chiusura del foro maculare

 

Il lembo invertito di membrana limitante interna (ILM) può costituire un’impalcatura per le cellule di Muller la cui migrazione e proliferazione sulla sua superficie inizia il processo di chiusura del foro maculare. L’obiettivo dello studio era stabilire un modello in vitro dell’interazione tra ILM e le cellule di Muller. La vitrectomia con lembo ILM invertito è stata eseguita in 23 pazienti a causa di un foro maculare a tutto spessore (FTMH). Dopo la dissezione del lembo invertito, l’area del peeling ILM è stata estesa e il materiale è stato raccolto per esperimenti di coltura cellulare.
Le cellule Muller coltivate su piastre cellulari aderenti hanno mostrato una crescita significativamente migliore rispetto alle piastre in sospensione. I nostri risultati rivelano che la presenza dell’ILM può superare l’effetto inibitorio della crescita della superficie non adesiva. Inoltre, l’ILM sembra essere la superficie di crescita ottimale in condizioni di normossia, mimando il microambiente dopo vitrectomia e ipossia, che è lo stato naturale per le cellule di Muller. Il tasso di chiusura di FTMH è stato del 100%.
Il nostro studio ha rivelato che in condizioni di coltura non adesive l’ILM derivato dal paziente costituisce una superficie di crescita ottimale per le cellule di Muller. Abbiamo dimostrato che l’ILM stimola efficacemente l’attaccamento, la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule di Müller in condizioni di normossia, come avviene dopo la vitrectomia. I risultati sostengono fortemente l’uso del metodo del lembo ILM invertito negli interventi chirurgici di chiusura del foro maculare.

Le operazioni di processo ottimizzate riducono la ritenzione del prodotto e l’ostruzione della colonna nelle colture cellulari di perfusione basate su ATF

 

La ritenzione del prodotto nelle fibre cave è un problema comune nei sistemi di coltura cellulare basati su ATF. In questo studio, sono stati studiati gli effetti di quattro principali fattori di processo sulla ritenzione del prodotto (anticorpo terapeutico/proteina ricombinante) utilizzando cellule ovariche di criceto cinese. Le fibre cave in polisulfone presentavano un tasso di ritenzione del prodotto dal 15% ± 8 al 43% ± 18% superiore a quelle in polietersulfone variabile con lavorazioni specifiche.
Una maggiore portata del raccolto e un tasso di cambio dell’ATF hanno aumentato la ritenzione del prodotto rispettivamente del 13% ± 10% e fino al 31% ± 13%. In questo studio, le fibre cave con pori di dimensioni maggiori (0,65 ) m) sembravano avere un aumento della ritenzione del prodotto del 38% ± 7% rispetto a quelle più piccole (0,2 ) m).
Ulteriori indagini hanno rivelato che gli effetti della dimensione dei pori sulla ritenzione potrebbero essere correlati alla distribuzione della dimensione delle particelle nel brodo di coltura cellulare. Una fibra cava con una dimensione dei pori più grande (& gt; 0,5 μm) può ridurre la ritenzione proteica quando nella coltura predominano piccole particelle (circa 0,01-0,2 mm di diametro). Tuttavia, se la maggior parte delle particelle ha un diametro maggiore di 0,2 pollici, una fibra cava con dimensioni dei pori più piccole (0,2 )m) potrebbe essere una soluzione per ridurre la ritenzione del prodotto.
In alternativa, l’ottimizzazione del processo può modulare la distribuzione delle dimensioni delle particelle verso una riduzione della ritenzione della produzione con fibre cave ATF selezionate. Questo studio per la prima volta mette in evidenza l’importanza di far corrispondere le corrette dimensioni dei pori delle fibre cave con la distribuzione delle particelle di coltura cellulare e offre metodi per ridurre la ritenzione del prodotto e l’intasamento della colonna di ATF nelle colture cellulari di perfusione.
PUNTI CHIAVE: Il materiale della colonna ATF potrebbe influire sulla ritenzione del prodotto durante la coltura di perfusione. Una maggiore portata del raccolto e un tasso di cambio dell’ATF hanno aumentato la ritenzione del prodotto. La corrispondenza della dimensione delle particelle di coltura e della dimensione dei pori dell’ATF è fondamentale per la modulazione della ritenzione.

L’ameloblastina promuove la polarizzazione delle linee cellulari di ameloblasti in un sistema di coltura cellulare 3-D

Studi su modelli animali con mutazioni nel gene dell’ameloblastina hanno suggerito che la proteina della matrice extracellulare ameloblastina (AMBN) svolge ruoli importanti nel controllo dell’adesione cellula-matrice e della polarizzazione dell’ameloblasta durante l’amelogenesi. Al fine di esaminare la funzione di AMBN nella polarizzazione e nella morfologia cellulare, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare 3D in vitro per esaminare l’effetto dell’AMBN e dell’aggiunta di amelogenina (AMEL) sulla linea cellulare di ameloblasti ALC.
Abbiamo inoltre utilizzato la microscopia confocale ad alta risoluzione per rilevare l’espressione dei marcatori di polarizzazione in risposta all’aggiunta di AMBN. L’aggiunta di AMBN alla matrice di coltura 3D ha determinato il raggruppamento e l’allungamento (rapporto di aspetto più elevato) dell’ALC in modo dose-dipendente.
La concentrazione molare di AMEL richiesta per ottenere questa risposta dall’ALC era 2,75 volte maggiore di quella dell’AMBN. Questo effetto di polarizzazione dell’ameloblastina era attribuibile direttamente a un dominio conservato evolutivo all’interno della sua regione codificata per l’esone 5. Anche la regione codificata dall’esone 6 ha influenzato le interazioni tra le cellule AMBN, ma in misura minore.
I cluster formati con AMBN sono stati polarizzati con l’espressione dell’assemblaggio di E-caderina, Par3 e Cldn1 nelle giunzioni cellula-cellula nascente. L’effetto di allungamento era specifico per le cellule epiteliali delle cellule ALC e LS8 del lignaggio ameloblastico. I nostri dati suggeriscono che AMBN può svolgere ruoli di segnalazione critici nell’inizio della polarità cellulare agendo come comunicatore tra le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice.
La nostra indagine ha importanti implicazioni per comprendere la funzione dell’ameloblastina nell’adesione alla matrice smalto-cellula e i risultati possono contribuire agli sforzi per sviluppare strategie per la rigenerazione del tessuto dello smalto.

 

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