Etichettatura isotopica spaziale stabile da parte degli aminoacidi in coltura cellulare: etichettatura pulsata di sferoidi multicellulari tridimensionali per l’analisi globale del proteoma

Le colture cellulari tridimensionali, o sferoidi, sono importanti sistemi modello per la ricerca sul cancro perché ricapitolano gli aspetti chimici e fenotipici dei tumori in vivo. Gli sferoidi sviluppano gradienti chimici radialmente simmetrici, risultando in popolazioni cellulari distinte. L’etichettatura isotopica stabile di amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) è un approccio consolidato per quantificare l’espressione proteica ed è stato precedentemente utilizzato in un formato a sequenza di impulsi per valutare i cambiamenti temporali.

In questo articolo, dimostriamo che le firme isotopiche distinte possono essere introdotte in popolazioni cellulari spaziali discrete, tracciando efficacemente le proteine nelle posizioni originali nello sferoide, utilizzando una piattaforma che chiamiamo SILAC spaziale. Le popolazioni di sferoidi sono state coltivate con mezzi isotopici leggeri, medi e pesanti e i gusci concentrici delle cellule sono stati raccolti mediante tripsinizzazione seriale. Le proteine sono state analizzate quantitativamente mediante cromatografia liquida ad alta prestazione-spettrometria di massa tandem.

Le firme isotopiche correlate con la posizione spaziale e la posizione dell’isotopo non hanno un impatto significativo sul proteoma di ogni singolo strato. SILAC spaziale può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti proteomici nei diversi strati dello sferoide e per identificare i biomarcatori proteici in tutta la struttura. Mostriamo che le etichette SILAC possono essere pulsate discretamente in posizioni discrete, senza alterare il proteoma dello sferoide, promettendo futuri studi farmacodinamici e farmacocinetici combinati.

Il lembo invertito di membrana limitante interna (ILM) può costituire un’impalcatura per le cellule di Muller la cui migrazione e proliferazione sulla sua superficie inizia il processo di chiusura del foro maculare. L’obiettivo dello studio era stabilire un modello in vitro dell’interazione tra ILM e le cellule di Muller. La vitrectomia con lembo ILM invertito è stata eseguita in 23 pazienti a causa di un foro maculare a tutto spessore (FTMH). Dopo la dissezione del lembo invertito, l’area del peeling ILM è stata estesa e il materiale è stato raccolto per esperimenti di coltura cellulare.

Le cellule Muller coltivate su piastre cellulari aderenti hanno mostrato una crescita significativamente migliore rispetto alle piastre in sospensione. I nostri risultati rivelano che la presenza dell’ILM può superare l’effetto inibitorio della crescita della superficie non adesiva. Inoltre, l’ILM sembra essere la superficie di crescita ottimale in condizioni di normossia, mimando il microambiente dopo vitrectomia e ipossia, che è lo stato naturale per le cellule di Muller. Il tasso di chiusura di FTMH è stato del 100%.

Il nostro studio ha rivelato che in condizioni di coltura non adesive l’ILM derivato dal paziente costituisce una superficie di crescita ottimale per le cellule di Muller. Abbiamo dimostrato che l’ILM stimola efficacemente l’attaccamento, la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule di Müller in condizioni di normossia, come avviene dopo la vitrectomia. I risultati sostengono fortemente l’uso del metodo del lembo ILM invertito negli interventi chirurgici di chiusura del foro maculare.