Rilevamento diretto del coronavirus felino con tre test immunocromatografici rapidi basati sull’antigene e PCR in tempo reale nei rifugi per gatti

Effetto dell’inattivazione termica sulla rilevazione della sindrome respiratoria acuta grave – coronavirus-2 (SARS-CoV-2) con   reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in   tempo reale (rRT-    PCR   ): evidenza da uno studio in Etiopia

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è di grande importanza per la salute pubblica e il suo campione dovrebbe essere maneggiato in sicurezza a causa delle preoccupazioni sulla possibile trasmissione agli operatori sanitari. L’inattivazione termica del campione prima dell’isolamento dell’acido nucleico può consentire processi di analisi sicuri. Pertanto, è importante valutare l’effetto dell’inattivazione del calore sul rilevamento di SARS-CoV-2 RT-PCR in condizioni di risorse limitate.
Uno studio sperimentale è stato condotto presso l’Ethiopian Public Health Institute (EPHI) dal 25 settembre al 15 ottobre 2020. Sono stati raccolti un totale di 188 tamponi orofaringei da casi sospetti di COVID-19 riferiti a EPHI per il test SARS COV-2. 
Un lotto del campione è stato inattivato a 56°C per 30 minuti e l’altro   lotto è stato conservato a 4°C per un periodo di tempo simile. L’estrazione e il rilevamento dell’RNA sono stati eseguiti utilizzando i protocolli del kit DAAN Gene   . Abbott m2000 RT-PCR è stato utilizzato per l’amplificazione e il rilevamento. L’analisi dei dati è stata eseguita utilizzando SPSS versione 23.0; I test di correlazione del chi quadrato e di Pearson sono stati utilizzati per l’analisi qualitativa e semiquantitativa. Un valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Di tutti i 188 campioni, 119 (63,3%) erano positivi e 69 (36,7%) negativi nel gruppo non inattivato. Al contrario, 115 (61,2%) campioni erano positivi e 73 (38,8) negativi nel lotto di campioni inattivati ​​al calore. L’indice di positività tra i gruppi non ha mostrato differenze statisticamente significative (p> 0,05). La differenza media nel valore di soglia del ciclo (Ct) tra i due   gruppi del gene ORF1a / b e del gene N era 0,042 (IC 95% – 0,247-0,331; t = 0,28; p = 0,774) e 0,38 (IC 95% 0,097-0,682; t = 2,638; p = 0,010).
L’inattivazione termica a 56°C per 30 min non ha influito sulla rilevazione qualitativa di SARS-CoV-2 rRT-PCR. Tuttavia, la scoperta ha mostrato che c’era un aumento statisticamente significativo del valore Ct dopo l’inattivazione termica rispetto ai campioni non trattati. Pertanto, i risultati falsi negativi per campioni con un valore Ct elevato (Ct> 35) si sono rivelati una sfida per questo protocollo. Pertanto, dovrebbero essere studiati metodi alternativi di inattivazione e considerare ulteriori ricerche.

DirectDetect SARS-CoV-2 Direct RT –   PCR in   tempo  reale    utilizzando i campioni dei pazienti

Il COVID-19 è una malattia infettiva che ha causato una pandemia globale che colpisce persone in tutto il mondo. Poiché il rilevamento delle malattie e l’introduzione dei vaccini continuano, sono ancora necessari strumenti diagnostici efficaci per soddisfare le esigenze di test continui. Questo studio preliminare ha valutato un nuovo test diagnostico SARS-CoV-2 chiamato DirectDetect SARS-CoV-2 Real Time Direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) basato su una   dimensione del campione limitata di 24 campioni di respiro con 14 SARS-CoV – 2 -pazienti positivi. Il test è superiore ad altri test disponibili in commercio in quanto non richiede il mezzo di trasporto del virus o l’estrazione dell’RNA virale prima dell’amplificazione e del rilevamento dell’acido nucleico.
  • Questa capacità trasforma ore di tempo di preparazione del campione in una procedura che richiede minuti, eliminando la necessità di molti reagenti costosi che possono essere difficili da ottenere durante il picco nel test dell’acido nucleico durante una pandemia.
  • I risultati mostrano una concordanza positiva del   94,7, 100 e 94,7% tra tamponi asciutti con campioni, campioni trattati e non trattati testati con DirectDetect SARS-CoV-2   RT-PCR diretta in tempo reale rispetto ai test utilizzati in laboratorio clinico, rispettivamente.
  • I risultati indicano che DirectDetect può essere utilizzato per molti diversi tipi di campioni riducendo il numero di reagenti e il tempo necessario per la diagnosi.
  • Sebbene questo studio mostri risultati promettenti utilizzando i risultati DirectDetect, è necessaria un’ulteriore convalida di questo test con un set più ampio di campioni per valutare le prestazioni effettive di questo test.
  • Il rilevamento tempestivo dei fattori eziologici è importante per il successo del trattamento di un ascesso ileopsoas (IPA). Lo scopo di questo studio era di testare l’utilità clinica della reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale che prende di mira il   gene mecA  per gli stafilococchi meticillino-resistenti (MRS) e il gene 16S rRNA per i pan-batteri. Il nostro studio diagnostico retrospettivo ha incluso 22 pazienti che mostravano IPA e quattro pazienti con aree non infettive del tumore ileopsoas sottoposti a tomografia computerizzata   o biopsia ecografica e/o chirurgia.
I sintomi clinici, i dati sierici, l’analisi di imaging e la coltura microbiologica dei tessuti sono stati utilizzati per diagnosticare l’IPA. L’accuratezza diagnostica della PCR in tempo reale è stata determinata sulla base della diagnosi dei risultati dell’IPA e della coltura microbica. La coltura microbica è risultata positiva per 12 casi di IPA, di cui 2 infezioni da MRSA. Dei 12 IPA positivi in ​​coltura, 16S rRNA-PCR era positivo in 12 e MRS-PCR in due. Dei 10 casi di IPA negativi alla coltura, inclusi 3 casi di tubercolosi, 16S   rRNA-PCR era positivo in 8 e MRS-PCR era positivo in 2. Nei pazienti con massa ileopsoas non infettiva, né 16S rRNA né MRS-PCR hanno rilevato un’infezione batterica . GOTTA.
Sensibilità, specificità, valori predittivi positivi e negativi di 16S rRNA-PCR nella diagnosi di IPA erano rispettivamente 0,91, 1,00, 1,00 e 0,67, mentre quelli per la diagnosi di infezione da MRS mediante MRS-PCR erano 1,00, 0,92, 1,00 , e 0,50 rispettivamente. La PCR in tempo reale mirata al DNA batterico può rilevare il DNA batterico nei casi negativi alla coltura e fornire una migliore rilevabilità dell’infezione da MRS nei pazienti IPA.

Test PCR  quantitativi   in ​​tempo  reale   per     la diagnosi simultanea del virus della laringotracheite infettiva, del virus della malattia di Newcastle e del metapneumovirus aviario nel pollame

La malattia di Newcastle (ND), la laringotracheite infettiva (ILT) e il metapneumovirus aviario (aMPV) possono essere tutti simili, il che rende fondamentale una rapida differenziazione. Qui abbiamo adattato i test diagnostici molecolari preesistenti per NDV e ILTV e sviluppato nuovi test per aMPV A e B da utilizzare in   condizioni di termociclaggio sincronizzato. Tutti i test sono stati eseguiti in modo equivalente con linearità nell’intervallo dinamico di 5 log   10   , limite di rilevamento ripetibile (R²> 0,99) di ≥ 10 copie target ed efficienze di amplificazione comprese tra 86,8% e 98,2%. L’uso di campioni biologici per NDV e ILTV ha mostrato una specificità del 100%. Condizioni di amplificazione identiche semplificheranno le procedure di rilevamento nei laboratori diagnostici.
Lo scopo di questo studio era il rilevamento diretto del coronavirus felino mediante PCR in tempo reale e tre diversi test di immunocromatografia rapida (RIM) per rilevare gli antigeni nei campioni felini dei rifugi. L’utilità dei test RIM è stata confrontata in base alla sensibilità e specificità calcolate per ciascuno dei test RIM. Sono stati testati  settanta campioni fecali di gatti di rifugio in quarantena   . Dei 70 campioni analizzati mediante PCR in tempo reale, 44 (62,9%) erano positivi.

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PMA Real-Time PCR Bacterial Viability Kit - Legionella pneumophila (mip)

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Novel Coronavirus COVID-19 (2019-nCoV) Real Time RT-PCR Kit

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PMA Real-Time PCR Bacterial Viability Kit - Salmonella enterica (invA) PMAxx

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PMA Real-Time PCR Bacterial Viability Kit - Listeria monocytogenes (hly) PMAxx

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Sealing film, qPCR Optical (pressure-sensitive adhesive) ABI Type, 100/pk

P1001-QPS MTC Bio 100/pack 160.7 EUR

Human Real-time PCR DNA Quantitation after QPCR DNA Damage Analysis Kit

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Rat Real-time PCR DNA Quantitation after QPCR DNA Damage Analysis Kit

DD2R Detroit R&D 1 Kit 430 EUR

hsa-mir-521 Real-Time RT-PCR Detection and U6 Calibration Kit

20-abx097601 Abbexa
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PMA Real-Time PCR Bacterial Viability Kit - E. coli O157:H7 (Z3276)

31037 Biotium 1kit 428 EUR

Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green

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PMA Real-Time PCR Bacterial Viability Kit - E. coli O157:H7 (Z3276) PMAxx

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0.1ml 8-tube Real-Time PCR strip, flat cap, white, sterile, 125 pcs/pk

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0.2ml 8-tube Real-Time PCR strip, flat cap, white, sterile, 125 pcs/pk

210208R-13pk ACTGene 168 EUR

0.2ml 12-tube Real-Time PCR strip, flat cap, white, sterile, 80 pcs/pk

210212R-13pk ACTGene 170 EUR

SEALING FILM CYCLERSEAL, POLYPROPYLENE, 60 µM, CLEAR, NONSTERILE, BULK

PCR-TS CORNING 100/pk 192 EUR

SEALING FILM, ALUMINUM, 50 µM, NONSTERILE, BULK

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384 WELL PCR MICROPLATE FOR ROCHE 480 LIGHT CYCLER, WHITE (NO SEALING FILM)

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96 WELL PCR MICROPLATE FOR ROCHE 480 LIGHT CYCLER, CLEAR (NO SEALING FILM)

PCR-96-LC480-C-NF CORNING 10/pk 199 EUR

96 WELL PCR MICROPLATE FOR ROCHE 480 LIGHT CYCLER, WHITE (NO SEALING FILM)

PCR-96-LC480-W-NF CORNING 10/pk 199 EUR

Ultra Clear Adhesive PCR Plate Seals, Optically Clear Sheets

GP506 GenDepot 50 sheets 228 EUR

hsa-let-7a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097603 Abbexa
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hsa-let-7b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097604 Abbexa
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hsa-let-7c Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097605 Abbexa
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hsa-let-7d Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097606 Abbexa
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hsa-let-7e Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097607 Abbexa
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hsa-let-7f Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-let-7g Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-7 Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-9* Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097615 Abbexa
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hsa-mir-10a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097616 Abbexa
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hsa-mir-10b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-10a* Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097618 Abbexa
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hsa-mir-15a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097619 Abbexa
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hsa-mir-15b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-16 Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-18a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

20-abx097625 Abbexa
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hsa-mir-18b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-20b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-23a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-23b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-25 Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-26a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-26b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-27a Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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hsa-mir-27b Real-Time RT-PCR Detection and cel-mir-39-3p Calibration Kit

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Significativamente più gatti (   p    <0,05) sono risultati positivi che negativi. Né l’età né il sesso dei gatti hanno giocato un ruolo significativo (   p    > 0,05) nell’escrezione virale. La sensibilità dei test RIM è risultata bassa (<35%; test RIM A e C) a un livello soddisfacente (> 50%, test RIM B). Il numero di particelle virali determinato dall’analisi RT-PCR in tempo reale non era significativamente correlato ai risultati rilevati in nessuno dei saggi RIM (   p    > 0,05). I risultati di questo studio indicano che l’uso dei test antigenici rapidi RIM nello screening di routine per lo stato di eliminazione di FCoV nei gatti da rifugio è limitato a causa dell’elevato numero di risultati falsi negativi.

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