Sequenziamento e analisi del DNA genomico e del cDNA che codifica per il TNF-alfa nelle scimmie scoiattolo

L’esposizione transplacentare al cisplatino induce danni permanenti al    DNA mitocondriale e  genomico  fetale   nelle scimmie patas  .

Diverse scimmie Erythrocebus patas gravide sono state utilizzate in un precedente tentativo di modellare l’esposizione e la genotossicità al cisplatino transplacentare; la maggior parte degli animali è stata esposta alla fine della gestazione e le analisi dell’addotto cisplatino-DNA includevano solo il DNA genomico. Qui è stata determinata la formazione di addotti del DNA genomico e mitocondriale   nei feti di due scimmie gravide esposte alla fine del secondo trimestre di gravidanza. Più tessuti fetali sono stati ottenuti a dosi di 0,315 mg di cisplatino / kg di peso corporeo (totale 5,3 mg / m2) nei giorni 101 e 106 di gestazione.
I tagli cesarei sono stati eseguiti 24 ore dopo l’esposizione e 27 giorni dopo l’esposizione. Addotti genomici (g) -DNA del cisplatino sono stati osservati nelle ghiandole surrenali fetali, nel cervello, nel cuore, nei reni, nel fegato, nella pelle, nella milza e nel timo. Quando la placenta di due animali è stata divisa in quattro regioni concentriche a distanze crescenti dal   cordone ombelicale ed è stato determinato il g-DNA, i livelli di addotti di cisplatino al DNA erano simili in tutte e quattro le regioni.
Gli addotti mitocondriali (mt) -DNA erano superiori agli addotti del g-DNA nel fegato materno e fetale, nel cervello e nei reni, suggerendo che i mitocondri potrebbero essere un bersaglio specifico per la genotossicità del cisplatino. Lo studio mostra una significativa genotossicità fetale nel g-DNA e nel mt-DNA delle scimmie patas esposte al cisplatino nell’utero, suggerendo che anche feti umani esposti in modo simile possono subire danni al DNA indotti da farmaci.

Influenza    del DNA   – danno all’enediina C-1027 su SV40 intracellulare e    DNA genomico   nelle  cellule renali di scimmia   verde BSC-1

Questo studio descrive la capacità selettiva del C-1027 di indurre un danno limitato a doppio filamento nel DNA virale bersaglio. L’effetto dell’ambiente cellulare sull’attività di C-1027 è stato esaminato determinando l’entità e la   specificità del danno al DNA del virus scimmiesco 40 (SV40) in cellule di mammifero BSC-1 liticamente infettate e in preparazioni di DNA SV40 purificato   . Il danno C-1027 al DNA intracellulare SV40 è stato quantificato mediante analisi di conversione della forma topologica. A concentrazioni di C-1027 da 2 a 100 nM, è stata osservata una graduale diminuzione della forma intracellulare superavvolta I, accompagnata da un aumento della forma III, con una diminuzione del 50% della forma I a 50 nM. Anche il danno al DNA SV40 purificato è stato più pronunciato tra 10 e 100 nM C-1027.
con DNA purificato e intracellulare, l’analisi della digestione con enzimi di restrizione ha mostrato un danno a doppio filamento in molti siti specifici in tutto il genoma   , in particolare nella regione iniziale del genoma SV40 (ad esempio, nella grande sequenza codificante dell’antigene T).
Nessun danno significativo è stato osservato nelle regioni di origine (ORI) o di terminazione (TER) della replicazione di SV40. L’entità del danno C-1027 nel DNA delle cellule BSC-1 non infette è stata quantificata anche mediante elettroforesi su gel a campo di impulsi. A 0,1 nM (r = 2,8 x 10 (-5), dove l’incorporazione di timidina [3H] è stata ridotta dell’80%, sono stati rilevati 600 rad di danno equivalente in cellule BSC-1 non infette. A valori di C-1027 r che vanno da Da 1 x 10 (-4) a 40 x 10 (-4), le rotture a doppio filamento erano da 80 a 40 volte più frequenti nel DNA genomico di SV40 rispetto alla cellula BSC-1. inibiscono l’accumulo di DNA intracellulare di SV40 rispetto all’incorporazione di timidina [3H] in cellule BSC-1 non infette Pertanto, la sintesi del DNA di SV40 sembra essere meno sensibile ai cambiamenti indotti da C-1027 rispetto alla replicazione in cellule BSC-1 non infette.

Organizzazione genomica di sequenze a basso numero di copie associate al DNA     deca-satellite    nel    genoma della scimmia

Il segmento di DNA della scimmia verde africana precedentemente descritto (clonato nel fago lambda MkA) contiene una decasatelite collegata a sequenze di DNA che si stima si verifichino una volta per genoma. Le sequenze omologhe a sequenze a basso numero di copie in lambda MkA sono anche associate al DNA satellite specie-specifico nel genoma umano e del topo   . Il secondo clone, lambda Mk8, contiene una regione del DNA di scimmia che è collineare e omologa alla porzione a basso numero di copie della sequenza lambda MkA, ma manca di sequenze satellite   .
I due segmenti clonati differiscono in modo significativo, a partire da un punto vicino alla regione del DNA satellite in lambda MkA. Gli esperimenti di blotting del DNA indicano che lambda Mk8, ma non lambda MkA, rappresenta un’organizzazione genomica tipica e che i segmenti a basso numero di copie si verificano solo una volta per genoma aploide. I dati suggeriscono che riarrangiamenti come delezioni o inversioni nelle cellule di scimmia sono in parte responsabili della struttura lambda di MkA. Ulteriori riarrangiamenti possono essersi verificati durante la clonazione in E. coli. Questa regione cromosomica unica può essere particolarmente soggetta a ricombinazione.

Struttura parziale del gene della filossina dalla   rana scimmia gigante  Phyllomedusa bicolor: clonazione parallela del DNA del precursore c    e    del DNA genomico da       secrezioni cutanee liofilizzate.

Phyloxin è un nuovo prototipo di peptide antimicrobico dalla pelle bicolore di Phyllomedusa. Qui descriviamo l’identificazione parallela e il sequenziamento di un trascritto precursore della filossina (mRNA) e una struttura genica parziale (DNA genomico) dallo stesso campione di essudato cutaneo liofilizzato utilizzando la nostra tecnica di clonazione recentemente descritta.
  • Il frame di lettura aperto del precursore della filossina era identico nella sequenza nucleotidica a quella precedentemente descritta e l’allineamento con la sequenza nucleotidica derivata dal DNA genomico indicava la presenza di un introne di 175 bp situato in una posizione quasi identica a quella delle dermaseptine.
  • L’organizzazione strutturale altamente conservata   dei geni peptidici di secrezione cutanea in P. bicolor   può quindi essere estesa per includere il gene codificante la filossina (plx).
  • Questi dati rafforzano ulteriormente la nostra affermazione che l’applicazione della metodologia descritta può fornire solidi dati genomici / trascrittomici / peptidomici senza la necessità di uccidere i campioni.
Se una gamma di citochine e fattori di crescita che sono stati caratterizzati da cellule umane fosse testata in primati non umani, i risultati di tali approcci permetterebbero lo sviluppo di saggi per il rilevamento e la quantificazione delle citochine in modelli sperimentali. Il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-alfa) è un’importante citochina pluripotente che svolge un ruolo chiave nella difesa dell’ospite. Finora non sono stati riportati dati molecolari completi per il TNF-alfa di scimmia scoiattolo. I primer della reazione a catena della polimerasi   (PCR) sono stati utilizzati per tracciare gli introni, confrontando le dimensioni dei prodotti ottenuti utilizzando cDNA e DNA genomico come modelli.

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Il DNA genomico è costituito da quattro esoni e tre introni di 1793 nucleotidi. Il cDNA corrispondente è costituito da 702 nucleotidi e l’analisi filogenetica ha mostrato che Saimiri sciureus era più strettamente correlato al genere Aotus, i primati del Nuovo Mondo, rispetto ai primati del Vecchio Mondo (genere Macaca e Papio). La proteina TNF-alfa dedotta è composta da 233 aminoacidi che sono 82% identici agli esseri umani, il 95% alle scimmie del Nuovo Mondo e il 79% alle scimmie del Vecchio Mondo. Il cDNA di TNF-alfa clonato sarà utile per quantificare il TNF-alfa a livello di mRNA.

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